PCR test si zaslúšil slávu už dávno, nie len pre štúdium DNA

Termocykler pre PCR test

Až PCR test na COVID-19 preslávil PCR metódu, hoci už pred desiatkami rokov zmenila molekulárnu biológiu a štúdium DNA. Jej tvorca Kary B. Mullis získal za vynájdenie tejto metódy Nobelovu cenu za chémiu v roku 1993.

Polymerázová reťazová reakcia (PCR) je rýchla a lacná technika používaná na „zosilnenie“ – kopírovanie – malých segmentov DNA. Študovať  izolované kúsky DNA je takmer nemožné bez PCR amplifikácie, pretože na molekulárne a genetické analýzy sú potrebné značné množstvá vzorky DNA. Vďaka PCR metóde stačí minimálna vzorka, a preto bolo jej vynájdenie obrovským vedeckým prielomom.

Klinický význam PCR metódy

PCR amplifikácia je nepostrádateľným nástrojom s rôznym využitím v medicíne. Často sa používa na testovanie prítomnosti špecifických alel, napríklad v prípade skríningu potenciálnych nositeľov genetických mutácií pri plánovaní rodičovstva. Môže sa využiť aj na priamu diagnostiku prítomnosti ochorenia a mutácií vo vyvíjajúcom sa embryu. PCR sa týmto spôsobom prvýkrát použila na diagnostiku kosáčikovitej anémie prostredníctvom detekcie mutácie jedného génu.

Citlivosť diagnostických nástrojov na mutácie na onkogény a gény potlačujúce nádor sa zlepšila najmenej 10 000-krát vďaka metóde PCR, čo umožňuje skoršiu diagnostiku rakovín, ako je leukémia. PCR tiež umožnila jemnejšie a individualizovanejšie terapie pre pacientov s rakovinou. Okrem toho je možné použiť PCR na typizáciu tkaniva pre transplantáciu orgánov a nahrádza testy na zistenie krvnej skupiny založené na protilátkach. PCR má tiež využitie v oblasti prenatálneho testovania rôznych genetických chorôb z plodovej vody alebo z placenty.

Okrem toho, PCR výrazne revolučne zmenila diagnostický potenciál infekčných chorôb, pretože pomáha rýchlemu stanoveniu identity mikróbov, ktoré sa tradične nedali kultivovať, alebo ktoré na rast vyžadovali týždne. Patogény bežne detegované pomocou PCR zahŕňajú Mycobacterium tuberculosis, vírus ľudskej imunodeficiencie (HIV), vírus herpes simplex, syfilis a mnoho ďalších patogénov. Navyše, qPCR sa používa nielen na testovanie kvalitatívnej prítomnosti mikróbov, ale aj na kvantifikáciu bakteriálnej, hubovej a vírusovej záťaže.

PCR test v súdnych disciplínach

Akonáhle je DNA zostavená zo vzorky pomocou PCR metódy, môže byť použitá v mnohých rozličných laboratórnych postupoch, napríklad pri mapovaní genómu. Kvalitatívnu PCR je možné aplikovať na detekciu nielen ľudských génov, ale aj bakteriálnych a vírusových génov, no pracuje sa s ňou aj vo forenzných laboratóriách a je obzvlášť užitočná, pre potrebu iba malého množstva pôvodnej DNA. PCR je tiež cenná pri genetickej daktyloskopii.

PCR test má niekoľko krokov

Celý proces metódy PCR je automatizovaný a je možné ho dokončiť za niekoľko hodín. Riadi ho prístroj nazývaný termocyklér, ktorý je naprogramovaný tak, aby každých niekoľko minút menil teplotu reakcie, aby sa umožnila denaturácia a syntéza DNA. PCR sa opiera o tepelne odolnú DNA polymerázu z teplomilnej baktérie Thermos aquaticus (Taq). Použitím PCR metódy na amplifikáciu segmentu DNA sa vzorka najskôr zahreje, aby sa DNA denaturovala, alebo rozdelila na dve samostatné vlákna DNA. Potom DNA polymeráza zvaná „Taq polymeráza“ syntetizuje – vytvára – dve nové vlákna DNA. Tento proces má za následok duplikáciu pôvodnej DNA, pričom každá z nových molekúl obsahuje jeden starý a jeden nový reťazec DNA. Následne môže byť každé z týchto vlákien použité na vytvorenie dvoch nových kópií, a tak ďalej a tak ďalej, vždy o dvojnásobné množstvo. Cyklus denaturácie a syntézy novej DNA sa opakuje desiatky ráz, čo vedie k  vytvoreniu miliónov presných kópií pôvodného segmentu DNA.

Špecifiká troch základných krokov reakcie PCR:

Denaturácia: Na amplifikáciu DNA je potrebné najskôr oddeliť dve vlákna templátovej DNA. K tomu dochádza zahriatím templátu dsDNA do bodu, kde sa vodíkové väzby prerušia medzi pármi báz. Výsledkom je oddelenie dvoch reťazcov DNA.

Žíhanie: Teplota sa zníži na rozsah, v ktorom sú priméry stabilné. Pri tejto teplote sa môžu priméry spojiť s jednovláknovými templátovými reťazcami DNA. Taq polymeráza je pri tejto teplote tiež stabilná a môže sa viazať na priméry.

Predĺženie: Teplota sa potom mierne zvýši na ideálnu teplotu pre Taq polymerázu (70- 75 ° C). Pri tejto teplote môže Taq polymeráza syntetizovať a predĺžiť cieľovú DNA rýchlo a presne.

PCR test
Zdroj: video Marka Temple z Western Sydney University (https://www.youtube.com/watch?v=7beN35g5xuM&t=643s)

PCR test na COVID-19

 Polymerázová reťazová reakcia (PCR) je laboratórna technika, ktorá používa selektívne priméry na „kopírovanie“ špecifických segmentov sekvencie DNA. PCR test na COVID-19 používa priméry, ktoré zodpovedajú segmentu genetického materiálu vírusu. To umožňuje vytvoriť veľa kópií tohto materiálu, ktoré možno použiť na zistenie, či je vírus prítomný alebo nie.

Pozitívny PCR test  na COVID-19 znamená, že je prítomný vírus SARS-CoV-2. Negatívny výsledok môže znamenať, že vzorka neobsahuje žiadny vírus alebo že je vo vzorke príliš málo vírusového genetického materiálu na to, aby sa mohol detegovať.

Testovanie na nový koronavírus používa upravenú verziu PCR nazývanú kvantitatívna polymerázová reťazová reakcia (qPCR). Táto metóda pridáva do procesu PCR fluorescenčné farbivá na meranie množstva genetického materiálu vo vzorke. V tomto prípade zdravotnícki pracovníci merajú množstvo genetického materiálu z vírusu.

Niektoré vírusy, vrátane SARS-CoV-2, sú tvorené skôr RNA ako DNA. Pri týchto vírusoch musí byť RNA pred kopírovaním zmenená na DNA. Tento proces sa nazýva reverzná transkripcia PCR (rtPCR).

Genomický výskum bol ústredným bodom pochopenia ako PCR metódou pomôcť pri pandémii COVID-19.